你相信“光”嘛!

光是電磁波，波長100nm-400nm稱為紫外光，400nm-780nm之間的光可被人眼觀察到，大于780nm稱為紅外光。人們只所以能夠看到色彩，是因為光照射到物體上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色，是因為植物吸收了光中的紅色光譜。酶標儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。

“光”與酶標儀

酶標儀，即酶聯免疫檢測儀，用來檢測ELISA反應后的吸光度值，主要由光路系統與信號采集系統組成。工作原理為：

光源燈發出的光波經過濾光片或單色器變成一束單色光，該單色光一部分被標本吸收，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上;

光電檢測器將光信號轉換成相應的電信號，經過一系列信號處理后送入微處理器進行數據處理和計算，最后顯示結果。

酶標儀 分類

按濾光方式分類

分為濾光片式酶標儀(固定波長酶標儀)、光柵式酶標儀(全波長酶標儀)，這兩種都是屬于光吸收酶標儀;

濾光片是光學玻璃片鍍制光學膜層，使濾光片對通過的波長發生變化，將不需要的波長光隔開。根據選配的濾光片，只能截取特定波長進行檢測。

光柵型是使用物理性衍射光柵原理在不同角度將白光光源分開，再通過一系列狹縫將已選取的激發波長分出來。光柵型酶標儀可以截取光源波長范圍內的任意波長，靈活度更高。

目前濾光片系統因價格較為便宜，檢測靈敏度高，帶寬的可選擇性強，可以進行快速的濾光片切換等優點，其應用更廣。

討論--光柵和濾光片的區別比較

a、光的純度區別比較

光電檢測以采用純度高的光為佳，但不管采用哪種分光器，都不可能得到絕對純的光。

光柵：就光柵分光后的一點而言，光是純的，但由于透光孔具有一定寬度，比色皿所接受的光，是一個在指定波長附近波段上的等強的光。

濾光片：經濾光片分光后，通過透光孔被比色皿所接受的光也是一個波段，但在指定波長上光的強度最高，呈正態分布。

b、光的穩定性區別比較

光柵：棱鏡或者光柵片的繞軸旋轉，由于不可避免的機械誤差，并且小角度的偏差經過2-3次反射，會造成很大的偏差，造成波長的不穩定。另外光柵是窄縫，其能量也會很弱，小的檢測電壓信號為了獲得大的電壓值，必須以大倍數放大，這樣誤差也會被放大，會造成檢測的不穩定

濾光片：由于從同一濾光片上每一點透過的光的波長都是相同的，每個位置是通過光偶準確定位，不受儀器本身機械誤差的影響，所以，光強經會聚后，能量很高，電壓信號也會相對強，主流光很強，其它雜光的影響就會很弱很弱，可以忽略到不計，誤差也會很小，光是穩定的，檢測相對很穩定。

c、設備后期維護區別

光柵：一旦出現螺絲松動，傳動誤差，更換燈泡，造成中心波長偏移，那一般很難再調整回合適位置，必須由專業廠家來用專業設備調試完成，事實上國內大多數用戶因為沒有得到這方面的培訓與告知，所以基本用了一年以后，發生了偏差也不會去找廠家去校準了。

濾光片：結構簡單，便于維護。只要稍加培訓即可完成維護。

d、儀器檢測靈敏度區別

濾光片具有非常好的透光率 (可高于85%)，也就是說光能量的損失比較少。在一個熒光檢測中，經過濾光片進入樣本的激發光和從樣本透過濾光片進入檢測器的發射光都只有少量的損失(大約10%)。光的損失較少，光的能量自然較大，熒光的信號自然很容易檢測。這是獲得高信噪比(SNR)的最初始保證。所以，由于有高的信噪比(SNR)保證，濾光片系統從酶標儀誕生以來一直就是高靈敏度檢測的黃金標準。我們也不難發現很多有光柵型酶標儀的廠家在一些檢測靈敏度要求比較高的高端應用(如：TRF、TR-FRET、等)中，都會有另外配上濾光片模塊的設計。因為這些高端的應用，光柵系統未能有滿意的效果或干脆做不到。

光柵系統帶來方便，但也有一些缺點。基于光路設計的問題，光柵的光能損失比濾片大很多。在熒光檢測中，光源經過光柵而成的激發光已比原來的少了能量。樣本被激發后會放出發射光，發射光會透過光柵去分隔出需要的波長。被分隔后的發射光能量再損失。光柵酶標儀的靈敏度沒有濾光片酶標儀好的，所以在高端光柵型的酶標儀也要配備濾光片模塊才能進行TRF、TR-FRET等高靈敏度需求的檢測。

按功能分類

可分為單功能酶標儀(分為光吸收、熒光、化學發光等)和多功能酶標儀。多功能酶標儀是以上兩種或更多檢測模塊的集成，通常情況下至少可提供光吸收、熒光這兩種最常見檢測功能，而一些中高端多功能酶標儀還可支持化學發光、時間分辨熒光、熒光偏振、生物發光共振能量轉移，甚至還可以支持“Western Blot”和“上轉換發光”等檢測。

用什么“光”來檢測量

測量波長的原理

光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。

檢測單位用OD值表示，OD是opticaldelnsity(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度，OD=10g(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值。根據Bouger-amberT-beer法則，OD值與光強度成下述關系：

E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表示被吸收的光密度，Ⅰ0為在檢測物之前的光強度，Ⅰ為從被檢測物出來的光強度。

OD值由下述公式計算：

E=OD=C×D×E

其中：C為檢測物的濃度;D為檢測物的厚度;E為摩爾因子。

在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長，在此波長下，此物質能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結果的不準確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。

但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個參照波長，以消除這個不準確性。在參照波長下，檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。

常用波長

一般酶標儀的測定波長在400～750nm或800nm之間，完全可以滿足ELISA的顯色測定。

目前國內常見的ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下，經HRP作用，分別氧化為二氨基偶氮苯(DAB)和聯苯醌。

當pH值為5.0左右時，DAB在450nm波長處有最大吸收;

當pH值降為4.0時，最大吸收波長移至492 nm，同時摩爾消光系數變大，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。

TMB的氧化產物聯苯醌在波長450nm處有最大消光系數，如果HRP量少，H：O：和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。

降低pH，即可使藍色的陽離子根轉變為黃色的聯苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產物穩定90min。

450nm和492nm兩個波長是目前ELISA測定最常用的，考慮到雙波長比色的需要，還應有630nm和405nm波長的濾光片。

單波長/多波長檢測

酶標儀有單波長和雙波長檢測功能有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。

所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進行比色測定;

而“雙波長”則除了用對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進行比色測定外，同時用對特異顯色不敏感的波長如630nm進行測定，酶標儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。

630nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，最好使用雙波長，且不必設空白孔。

吸光度測定范圍

通常，酶標儀的吸光度測定范圍在0～2.5之間即可以滿足ELISA的測定要求。早期的酶標儀可測定的吸光度一般在0～2.5之間，但現在基本上都做了拓寬，可達到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。因此，對于酶標儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要看在一定的吸光度范圍內的線性和精密度如何

檢測速度

酶標儀的檢測速度是指其完成比色測定所需要的時間。所謂天下武功唯快不破，檢測速度快，有利于提高檢測的精密度，即避免由于測定過程中，因測定時間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。目前市場上常見的酶標儀檢測速度都非常快，通常在數秒鐘內。

振板功能

酶標儀的震板功能是指酶標儀在對ELISA板孔進行比色測定前對其進行振蕩混勻，使板孔內顏色均一。目前市場上常見的酶標儀均有震板功能，有所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉等方式及振蕩幅度等任意調節。使用有震板功能的酶標儀，在進行ELISA測定，顯色反應完成加入終止液后，可不必振蕩混勻，直接放入酶標儀測定即可。

溫育功能

溫育功能是指酶標儀本身能按要求自動精確地控制儀器內部的溫度，使得ELISA測定中微孔板條的溫育過程可在儀器內部完成，而無需再外配溫箱。

溫育功能只是酶標儀的一個附加功能，是否具有并不能說明酶標儀檔次的高低及儀器的優劣。作為實驗室是否選擇，則可根據自己實驗室的條件及需要來決定。

軟件功能

軟件功能是指酶標儀所具有的對ELISA定性和定量測定及其他測定方式如酶標動力學、紫外和凝集等數據的統計分析并報告結果的功能。軟件功能是中高檔酶標儀的一個非常重要的功能。

軟件在讀數前可設置讀數孔、波長、計算公式等內容，在讀數后顯示相關數據。對于用戶來說，好的軟件功能，對實際工作會有較大的幫助。ELISA定性測定，酶標儀如具有陽性判斷值(cut-off)及其測定“灰區”(即指測定吸光度處于cut—off周圍的一定區域，此區域內結果應為“可疑”)的統計計算功能，不但方便了實驗室工作人員，而且在某些特定的情況下，有很高的實用價值。

檢測項目

▶臨床檢驗項目

★感染免疫室檢測：乙肝五項(HBV)、甲肝抗體(HAV)、戊肝抗體(HEV)、丙肝抗體(HCV)、免疫球蛋白(IgG)、艾滋病抗體(HIV)、梅毒螺旋體抗體......

★血液免疫學檢測：免疫球蛋白A/G/M/E/D、免疫球蛋白輕鏈κ/λ、補體C3/C4、CRP、類風濕因子、前白蛋白、銅藍蛋白、觸珠蛋白、β2微球蛋白、轉鐵蛋白、酸性糖蛋白、超敏CRP、血清淀粉樣物質A、γ痕跡蛋白、循環免疫復合物、ANA、ENA......

★過敏原檢測：血清總IgE、特異性IgE及過篩試驗、ECP檢查......

★腫瘤標志物的檢測：癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、糖類抗原(CA199)、糖類抗原(CA125)、 糖類抗原(CA153)、鱗狀細胞癌抗原(SCC)......

★生殖醫學檢測：弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型和II型、抗精子抗體、抗子宮內膜抗體、抗卵巢抗體、抗滋養膜細胞抗體、抗hCG抗體......

▶食品安全檢測項目

★過敏原：食品 ;

★三聚氰胺：農產品和食品 ;

★二噁英：農產品和食品、環境樣品 ;

★獸藥殘留

★抗生素：農產品和食品 ;

★克倫特羅/瘦肉精：禽畜的尿、毛、肉、奶、飼料等 ;

★農藥殘留：農產品、食品、水、土壤等

★殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、植物/昆蟲生長調節劑 ;

★生物毒素：食品和飼料

★黃曲霉素;貝類毒素;嘔吐毒素;黃曲霉毒素B1;玉米赤霉烯酮;赭曲霉毒素A。

▶出入境檢驗檢疫項目

★衛生檢疫：出入境人員丙肝、HIV、梅毒抗體檢測 ;

★動物CIQ：豬傳染性胃腸炎病毒(生物素標記414 nm)，豬呼吸道冠狀病毒(生物素標記414 nm)，豬流行性腹瀉，雞傳染性法氏囊病(490 nm)，雞傳染性喉氣管炎，牛傳染性鼻氣管炎(450 nm)等出入境動物病毒檢測;

★植物CIQ：番茄黑環病毒檢測、豇豆重花葉病毒(堿性磷酸酶標記405 nm)。

▶細胞增殖與細胞毒性檢測

★MTT 法 ：

通過測定570nm 波長處的吸光值，可間接反映活細胞的數量。細胞增殖越多越快，則吸光值越高;細胞毒性越大，則吸光值越低。

★CCK-8：

測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

▶蛋白濃度測定(比色法)

★BCA法：562 nm;

★考馬斯亮藍法：595 nm;

★660nm蛋白分析定量試劑：660nm。

▶內毒素檢測

★動態顯色法(微量技術)：405nm。

▶酶活測定

原理：酶活性的檢測基于底物NADH的消耗或產生，可以通過檢測NADH而間接定量酶活性。

檢測方法：37℃保溫下，在340nm處使用動力學檢測方法測定酶活性。

★具體應用：谷丙轉氨酶(ALT)的檢測(肝功能) 、尿素氮的檢測(脲酶-NADH法)(腎功能)、葡萄糖6磷酸脫氫酶的檢測(溶血病)、已糖激酶(血清葡萄糖)。